膜聯(lián)蛋白V可以與包括APC的熒光染料綴合。這種形式保留了其對磷脂酰絲氨酸(PS)的高親和力,因此可用作流式細(xì)胞儀分析正在經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的敏感探針。由于PS的外化發(fā)生在細(xì)胞凋亡的早期階段,APC膜聯(lián)蛋白V染色可以在比基于核變化(例如DNA片段化)的測定更早的階段鑒定細(xì)胞凋亡。 APC膜聯(lián)蛋白V染色先于膜完整性的喪失,這伴隨著由細(xì)胞凋亡或壞死過程引起的最新細(xì)胞死亡階段。因此,APC膜聯(lián)蛋白V染色通常與重要染料如碘化丙啶(PI)或7-氨基放線菌素(7-AAD)聯(lián)合使用,以使研究人員能夠識別早期凋亡細(xì)胞(7-AAD陰性,APC)膜聯(lián)蛋白V陽性)。具有完整膜的活細(xì)胞排除7-AAD,而死亡和受損細(xì)胞的膜對7-AAD是可滲透的。例如,被認(rèn)為存活的細(xì)胞是APC膜聯(lián)蛋白V和7-AAD陰性,而早期細(xì)胞凋亡的細(xì)胞是APC膜聯(lián)蛋白V陽性和7-AAD陰性,而晚期凋亡或已經(jīng)死亡的細(xì)胞都是APC膜聯(lián)蛋白V和7-AAD陽性。該測定不區(qū)分經(jīng)歷凋亡性死亡的細(xì)胞與由于壞死途徑而死亡的細(xì)胞,因?yàn)樵谌我磺闆r下,死細(xì)胞將用APC膜聯(lián)蛋白V和7-AAD染色。然而,當(dāng)隨時間測量細(xì)胞凋亡時,通??梢詮腁PC膜聯(lián)蛋白V和7-AAD陰性(存活或無可測量的細(xì)胞凋亡)追蹤細(xì)胞,APC膜聯(lián)蛋白V陽性和7-AAD陰性(早期細(xì)胞凋亡,膜完整性存在) )最后到APC膜聯(lián)蛋白V和7-AAD陽性(末期凋亡和死亡)。細(xì)胞通過這三個階段的運(yùn)動表明細(xì)胞凋亡。相比之下,單個觀察結(jié)果表明細(xì)胞本身是APC膜聯(lián)蛋白V和7-AAD陽性,它們揭示了關(guān)于細(xì)胞經(jīng)歷其死亡的過程的較少信息。
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 價格 |
E0701 | Cell Meter APC-Annexin V細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 適合于流式細(xì)胞儀 | 100 Tests | 2544RMB |
儲備溶液配制
1. APC-Annexin V原液(100X):
將含有0.2%BSA的200μLPBS加入到APC-膜聯(lián)蛋白V綴合物(組分A)的小瓶中并充分混合以制備100X APC-膜聯(lián)蛋白V儲備溶液。 注意:將重構(gòu)的100X APC-Annexin V儲備溶液儲存在4 ℃。 除非另有說明,否則所有未使用的儲備溶液應(yīng)分成一次性等分試樣,并在制備后儲存在-20°C。 避免反復(fù)凍融循環(huán)。
操作步驟
1.用測試化合物處理細(xì)胞一段所需的時間(用星形孢菌素處理的Jurkat細(xì)胞4-6小時)以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。注意:膜粘附細(xì)胞的膜聯(lián)蛋白V流式細(xì)胞術(shù)分析未經(jīng)常檢測,因?yàn)樵诩?xì)胞分離或收獲期間可能發(fā)生特定的膜損傷。
2.離心細(xì)胞,得到1-5×105個細(xì)胞/管。
3.將細(xì)胞重懸于200μL測定緩沖液(組分B)中。
4.向細(xì)胞中加入2μL100XAPC-膜聯(lián)蛋白V原液。
5.可選:將2μL100X碘化丙啶(組分C)加入細(xì)胞中,用于壞死細(xì)胞。
6.在室溫下孵育20至60分鐘,避光。
7.可選:在使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞之前,添加200至300μL的測定緩沖液(組分B)以增加體積。
8.使用具有FL4通道的流式細(xì)胞儀(Ex / Em = 635 / 660nm)監(jiān)測APC-膜聯(lián)蛋白V的熒光強(qiáng)度。當(dāng)?shù)饣ぜ尤爰?xì)胞時,使用FL2通道測量細(xì)胞活力。