膜聯(lián)蛋白V是研究細胞凋亡的有價值的工具。它用作檢測在細胞表面表達磷脂酰絲氨酸的細胞的探針,這是細胞凋亡以及其他形式的細胞死亡中發(fā)現(xiàn)的特征。有多種參數(shù)可用于監(jiān)測細胞活力。Annexin V-dye共軛物被廣泛用于通過測量磷脂酰絲氨酸(PS)的轉(zhuǎn)運來監(jiān)測細胞凋亡。在細胞凋亡中,PS轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜的外部小葉。磷脂酰絲氨酸在細胞表面的出現(xiàn)是細胞凋亡初始/中間階段的普遍指標,可以在觀察形態(tài)變化之前進行檢測。這種熒光TRITC-Annexin V偶聯(lián)物廣泛用于通過流式細胞儀或熒光顯微鏡監(jiān)測細胞凋亡。對于基于膜聯(lián)蛋白V的細胞凋亡檢測的微孔板檢測,我們建議您使用Cell Meter?試劑盒。
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 價格 |
E0203 | Annexin V, TRITC標記 | 100 tests | 2544RMB |
操作步驟
1.用膜聯(lián)蛋白V綴合物制備和孵育細胞:
1.1 制備膜聯(lián)蛋白V綴合測定緩沖液:10mM HEPES,140mM NaCl和2.5mM CaCl 2,pH 7.4。
1.2 用測試化合物處理細胞一段所需的時間(用星形孢菌素處理的Jurkat細胞4-6小時)以誘導(dǎo)細胞凋亡。
1.3 離心細胞,得到1-5×10 5個細胞/管。
1.4 將細胞重懸于200μLAnnexin V結(jié)合測定緩沖液中(來自步驟1.1)。
1.5 在細胞中加入2μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物。
可選:在細胞內(nèi)加入死細胞染色劑如碘化丙錠,用于壞死細胞。
1.6 余ncubate在室溫下進行30至60分鐘,避光。
1.7 在用流式細胞儀或熒光顯微鏡分析細胞之前,加入300μLAnnexin V結(jié)合測定緩沖液(來自步驟1.1)以增加體積(參見下面的步驟1.8)。
1.8 使用流式細胞儀或熒光顯微鏡監(jiān)測熒光強度(參見下面的步驟2或3)。
2.使用流式細胞儀分析:
通過使用具有適當(dāng)過濾器的流式細胞儀來量化膜聯(lián)蛋白V綴合物。
注意:粘附細胞上的膜聯(lián)蛋白V 結(jié)合流式細胞術(shù)分析未經(jīng)常檢測,因為在細胞分離或收獲期間可能發(fā)生特定的膜損傷。
3.使用熒光顯微鏡分析:
3.1 移液器從步驟1.6,將細胞懸浮液沖洗1-2次用甲nnexin V-結(jié)合測定緩沖液(來自步驟1.1) ,然后與A重懸細胞 nnexin V-結(jié)合測定緩沖液(來自步驟1.1) 。將細胞添加到蓋有玻璃蓋玻片的載玻片上。
注意:對于粘附細胞,建議直接在蓋玻片上生長細胞。與膜聯(lián)蛋白V綴合物(步驟1.6)孵育后,用Nnexin V結(jié)合測定緩沖液(來自步驟1.1)沖洗1-2次,并將A nnexin V結(jié)合測定緩沖液(來自步驟1.1)加回到蓋玻片中。在玻璃載玻片上翻轉(zhuǎn)蓋玻片并觀察細胞。在與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育后,細胞也可以在2%甲醛中固定,并在顯微鏡下觀察。
3.2 在熒光顯微鏡下用適當(dāng)?shù)臑V光片分析膜聯(lián)蛋白V綴合物的凋亡細胞。